本发明公开了一种南美蟛蜞菊花抗肿瘤提取物及其制备方法和用途。该提取物是在南美蟛蜞菊花的干燥粉末中加入溶剂提取；提取液经过滤、减压浓缩得到总提取物，加水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，减压回收分别得到石油醚部分、乙酸乙酯部分和水溶解部分，所得石油醚部分包括1个桉烷型倍半萜内酯、5个对映贝壳杉烷型二萜类化合物、2个齐墩果烷型三萜、1个环阿尔廷烷型三萜、1个甾醇类化合物、2个二肽类化合物和1个咖啡酸酯类化合物。本发明制得的提取物得率高，工艺流程简单，成本低廉，适合较大规模的制备。提取物具有广谱抗肿瘤活性，可以作为活性组份应用于预防和治疗肿瘤的药物中。