本发明提供了一种双特异性识别克百威和三羟基克百威抗体及其制备方法和应用。本发明还提供了采用该双特异性抗体制备得到的试纸条和酶联免疫试剂盒。本发明提供的双特异性抗体能够同时识别克百威和三羟基克百威，采用该双特异性抗体制成试纸条和酶联免疫试剂盒，能够同时检测克百威和三羟基克百威在样品中的残留，具有高灵敏度、高特异性的特点，检测过程方便快捷，操作简便，可用于田间和实验室大范围筛选和检测。