本发明公开了一种提取、分离三斑海马脂溶性成分的方法，具体为：首先提取脂溶性成分，并测定其最大紫外吸光峰的波长，然后以最大紫外吸光峰波长为检测波长，对其进行中压制备与纯化色谱硅胶柱层析分离、洗脱，得到去除胆固醇的三斑海马脂溶性分离物。本发明提取的脂溶性成分经过中压制备与纯化色谱硅胶柱层析，用不同极性溶剂进行台阶/线性梯度洗脱，获得极性不同的分离组分。其中，极性较大组分FrⅣ的生理活性物质含量较高，该组分中未检测出胆固醇；同时该组分能够抑制脂多糖刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症因子一氧化氮，且对细胞无毒副作用，对细胞存活性无显著影响。