本发明公开了一种提高米尔贝霉素发酵产物中米尔贝霉素A3含量的方法，包括：斜面菌种培养，液体种子培养，液体发酵培养等步骤，发酵培养过程中向发酵液中流加补料蔗糖溶液，尤其发酵到48h后，通过向发酵液中每天间歇或连续补入特异性的前体0.05％的乙酸钠溶液，显著提高了发酵产物中A3的含量，同时也提高了米尔贝霉素的发酵产量。