一种检测人血清中抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体‑MMAE偶联物中和抗体的方法，包括如下步骤：应用SK‑BR‑3细胞系作为靶细胞，研究药物生物活性；使用药物作为抗原免疫食蟹猴，使用药物F(ab)’2片段加强免疫，制备阳性多抗；应用SPE萃取技术对血清样本进行前处理，消除血清干扰，提高方法稳定性和药物耐受能力；基于药物活性方法开发中和抗体检测方法，应用于经处理后的血清样本中中和抗体的检测。本发明的方法源自基于细胞水平的生物活性方法，直接反映药物分子作用机理MoA；应用对药物作用更为敏感的SK‑BR‑3细胞，有利于方法灵敏度的提高；阳性对照抗体通过免疫非人灵长类制备，与真实样本的可比性更强；血清样本经前处理后再进行检测，检测结果更为稳定可靠。