本发明涉及一种利用亚临界和分子蒸馏联合制备罗汉果糖苷V的方法，其包括如下步骤：1)将罗汉果粉末进行亚临界萃取，获得罗汉果萃取物；2)将罗汉果萃取物进行分子蒸馏，得到含罗汉果糖苷V的轻组分。步骤1)中亚临界萃取时，温度为10－50℃，压力为0.5－2.0 MPa，时间为3－5 h。本发明方法包括原料粉碎预处理、亚临界萃取和分子蒸馏三个步骤，操作步骤简单便捷，耗时较短，适合规模化生产和应用；整个工艺过程中温度较低不会对香味物质进行破坏，对目标化合物影响较小，并且原料来自于自然界，在制备过程中并无引入有害物质，不存在有毒溶剂残留问题；采用本发明方法制备所得的罗汉果糖苷V纯度较高，纯度在94.6%以上。