本发明涉及胰岛素生产方法领域，公开了一种重组胰岛素及胰岛素类似物前体纯化方法。本发明为解决重组表达的胰岛素前体及胰岛素类似物前体在纯化制备过中存在的常规层析填料因不能耐受高盐上样、有机试剂用量大、成本高、产品纯度不高的问题，本发明采用以下技术方案：将离心后的发酵液上清经调节pH和离心后，直接上样经Capto S、Capto MMC、Uni PMM S、Uni MSP中的任何一种填料制备的层析柱进行吸附、分离纯化、洗脱，最终得到高纯度的重组胰岛素及胰岛素类似物前体；本发明与现有纯化方法相比操作简单，收率高，耗时短，对环境影响小，可大规模降低现有的胰岛素及胰岛素类似物的产品生产成本。