本发明公开了脂肪组织来源复合细胞群及其制备方法和应用。本发明所提供的脂肪组织来源复合细胞群的制备方法，包括如下步骤：(1)洗涤脂肪组织；(2)分离脂肪组织，所述洗涤后的脂肪组织依次经过1.5mm～2.0mm、0.8mm～1.0mm和0.5mm～0.7mm三种不同孔径的刀片式纳米脂肪移植乳化器，离心后将油滴层、成熟脂肪细胞层和生理盐水层去除，收集底部的复合细胞群层；用细胞筛过滤除去复合细胞群层中的细胞碎片和基质成份部分，离心，弃上清，即得所述脂肪组织来源复合细胞群。本发明通过在切割作用下破碎脂肪组织，降低了对脂肪组织的作用力，避免了对间充质干细胞等目标产物造成损伤，从而保护了细胞结构，提高了产物的治疗效果。