本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抗HB‑EGF单克隆抗体及其制备方法。本发明所述抗HB‑EGF单克隆抗体的制备方法是用纯化后的HB‑EGF蛋白作为免疫原，免疫BALB/c小鼠，提取免疫成功的小鼠脾脏淋巴细胞，通过细胞融合技术将淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，经过二轮亚克隆筛选后获得稳定分泌抗HB‑EGF的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，从而获得抗HB‑EGF单克隆抗体，本发明的抗HB‑EGF单克隆抗体可用于免疫印迹、免疫荧光等免疫学检测，所获抗体经验证具有良好的特异性结合能力。