本发明公开了一种洗涤缓冲液，其中，该洗涤缓冲液由HEPES和巯基化合物组成，所述缓冲液中HEPES摩尔浓度为19‑21mM，巯基化合物摩尔浓度为3‑6mM，所述洗涤缓冲液的pH值为7.5‑7.8。本发明还公开了采用该洗涤缓冲液提纯牛血红蛋白的方法。本发明的洗涤缓冲液，配制方便，用于阴离子交换层析提纯牛血红蛋白，能够得到高纯度的牛血红蛋白，纯度可达99％以上；本发明的提纯牛血红蛋白的方法，能够简化阴离子交换层析过程，纯化方法简单，采用本发明的洗涤缓冲液冲洗层析柱，能够得到高纯度的牛血红蛋白，并且收率可以达到90％以上，可直接作为后期化学交联聚合的原料，具有良好的工业应用前景。