本发明公开了一种检测微管蛋白抑制剂(3Z, 6Z)‑3‑((E)‑3‑(5‑叔丁基)‑1H‑咪唑基‑4‑基)亚甲基)‑6‑((E)‑3‑(3‑氟苯基)‑2‑丙烯亚基)哌嗪‑2, 5‑二酮的高效液相色谱法。本发明方法可快速准确的检测出微管蛋白抑制剂(3Z, 6Z)‑3‑((E)‑3‑(5‑叔丁基)‑1H‑咪唑基‑4‑基)亚甲基)‑6‑((E)‑3‑(3‑氟苯基)‑2‑丙烯亚基)哌嗪‑2, 5‑二酮及其光降解产物等杂质，操作简单，重现性好，灵敏度高，可较好地控制微管蛋白抑制剂产品质量，为合成和制剂工艺优化提供了保证。