本发明公开了一种表达PD‑L1单链抗体的新城疫溶瘤病毒的制备方法及应用，其突变型重组LaSota株新城疫病毒的F蛋白第112‑117位氨基酸残基突变为112‑R‑R‑Q‑R‑R‑F‑117，使其具备独立感染能力；将PD‑L1单链抗体基因通过同源重组插入至新城疫病毒LaSota株全长克隆P基因和M基因之间，获得最终改造后的全长克隆pBRN‑FL(112‑RRQRRF‑117)‑PDL1(ScFV)；通过鸡胚增殖和超速离心纯化重组病毒。本发明制备的rNDV‑LaSota(112‑RRQRRF‑117)‑PDL1(ScFV)重组病毒具有媲美LaSota原始毒株的安全性，同时具有强毒株的肿瘤杀伤能力和免疫检查点抑制功能。