本发明公开了一种新型埃博霉素生物合成基基因P3启动子及其制备方法和应用。P3启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明首次采用设计简并引物的方法扩增So ce M4埃博霉素生物合成基因的启动子，并对其进行克隆及启动子元件分析，并采用荧光素酶报告基因载体验证所得埃博霉素生物合成基因启动子的功能。所得新型埃博霉素生物合成基因簇启动子可为纤维堆囊菌埃博霉素生物合成转录调控及埃博霉素生物合成基因簇的异源表达奠定分子生物学基础，促进埃博霉素产量的提高，促进埃博霉素在生物医药方面的广泛应用。