本发明公开了一种添加D‑氨基酸混合物培养基及其制备方法与应用，将D‑氨基酸混合物加入培养基可提高乳酸乳球菌耐酸性和乳酸链球菌素(Nisin)产量。将原始菌株在加入D‑氨基酸混合物的培养基中发酵12h，培养到8h时Nisin产量达到最大，原始菌株提高1.5～1.7倍，8h酸应激存活率提高1.4～1.7倍。本发明的D‑氨基酸混合物对产物Nisin和菌株抗逆性有明显的影响，其中Nisin是一种安全无毒的食品防腐剂，D‑氨基酸在食品、医药等方面广泛应用。