一种具有生物素结合性能的绿色荧光融合蛋白及其制备方法和用途，绿色荧光融合蛋白基因中包含一个组氨酸标签基因、绿色荧光蛋白基因和链霉亲合素的功能区基因；本发明的具有生物素结合性能的绿色荧光融合蛋白为403个氨基酸的新型蛋白质，其中组氨酸标签是一个由6个组氨酸组成的标签，用于蛋白的鉴定和纯化；绿色荧光蛋白可以作为报告蛋白，用于检测和细胞活体的荧光成像；链霉亲合素功能区一方面具有和生物素结合的功能，能够简便迅速的和生物素结合；另一方面链霉亲合素功能区只保留了链霉亲合素的核心部分，使融合蛋白的分子量更小，生物检测更加容易。