本发明涉及生物纳米医药技术领域，具体涉及一种杂交纳米肿瘤疫苗的制备方法及其应用，该方法步骤为：充分混合肿瘤细胞裂解液(lysis)、多肽水凝胶水溶液和CpG‑ODN水溶液，向混合液中滴加氯化钠水溶液，直到混合液中氯化钠的浓度为0.9wt％；静置混合液获得稳定装载肿瘤杀伤性多肽/CpG/lysis的杂交纳米肿瘤疫苗。本发明的方法利用多肽水凝胶纳米载体作为桥梁，装载肿瘤细胞抗原和免疫激活剂，制备的肿瘤疫苗具有合适的粒径，可增加肿瘤细胞疫苗的细胞摄取和胞浆定位，更大程度的激活机体的固有免疫和适应性免疫，增加抗肿瘤免疫效应，解决普通肿瘤抗原疫苗易降解，免疫原性低，免疫反应激活效率低下等问题。本发明的杂交凝胶疫苗可应用于制备肿瘤疫苗药物。