本发明涉及一种纽莫康定B0丝氨酸类似物的分离纯化方法，所述分离纯化方法包括以下步骤：a)用聚合物基质色谱填料进行第一次层析富集，等度洗脱，收集纯度＞30％部分；b)用亲水作用色谱填料进行第二次层析纯化，等度洗脱，收集纯度＞60％部分；c)用反相硅胶基质色谱填料进行第三次层析纯化，等度洗脱，收集纯度＞80％部分；d)第三次纯化后，纽莫康定B0丝氨酸类似物纯度＞80％的层析液，减压浓缩除去溶剂后冻干，得到纽莫康定B0丝氨酸类似物。通过本发明的制备方法得到的纯度＞80％的纽莫康定B0丝氨酸类似物进行了结构鉴定，为进一步进行生物活性的筛选或对其进行结构修饰后再进行生物活性筛选，奠定了基础。