本发明公开了哺乳动物细胞高效电转染缓冲液，该缓冲液是对Cytomix缓冲液的进一步改良。该缓冲液中加入的无血清Opti‑MEM培养基、RPMI‑1640培养基及PBS缓冲液能对细胞起营养保护作用，能增加细胞存活率，同时加入的ATP和谷氨酰胺可阻止细胞质成分渗漏，加强细胞膜抗氧化作用，有利于电穿孔的重新闭合。本发明公开的电转染缓冲液，能够明显提高外源基因在目标细胞的电转染效率(高达64.82%)，并能提高细胞存活率(高达62.33%)。本发明还提供了该电转染缓冲液的制备方法，该方法操作简单，可操作性强。