本发明公开了一种分离洋艾内酯A、B的HPLC方法，色谱柱：Waters Sunfire C18液相色谱柱，规格为4.6mm×250mm、5μm；流动相：A相为体积百分浓度10％的甲醇水溶液，其中含有10mM手性添加剂；B相为体积百分浓度90％的甲醇水溶液，其中含有10mM手性添加剂；洗脱程序：0～5min，0％B；5～20min，0％～80％B；20～25min，80％～0％B；流速：1.0mL/min；柱温：35℃。本发明通过在流动相中添加手性添加剂D‑脯氨酰胺，无需借助手性色谱柱即可实现洋艾内酯A和洋艾内酯B的分离。因此本发明HPLC方法可用于检测洋艾内酯A中是否混有洋艾内酯B或洋艾内酯B中是否混有洋艾内酯A。