本发明埃可病毒9型VP1蛋白特异性抗原表位及其融合蛋白的制备、应用涉及基因工程技术、疫苗和诊断试剂领域。本发明是通过计算机分析埃可病毒9型表面蛋白VP1氨基酸序列，筛选出含强特异性抗原表位的蛋白片段，即第75位氨基酸至第102位氨基酸，第127位氨基酸至第140位氨基酸，第204位氨基酸至第237位氨基酸，第257位氨基酸至第300位氨基酸，这4个蛋白片段之间通过两个甘氨酸和一个丝氨酸连接，形成一个抗原表位融合蛋白。选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成该抗原表位融合蛋白的全新基因序列，利用基因工程技术，表达制备埃可病毒9型VP1蛋白抗原表位融合蛋白，用于埃可病毒抗体检测试剂的研制，及用于埃可病毒单抗和多抗制备。