本发明涉及一种用于表达THBS4蛋白的真核表达质粒、构建方法及应用，该真核表达质粒含有用于表达THBS4蛋白的基因片段，该用于表达THBS4蛋白的真核表达质粒的构建方法包括以下步骤：对含有THBS4基因的质粒进行双酶切，电泳并胶回收，得到回收产物THBS4目的片段；对pENTER质粒进行双酶切，电泳并胶回收，得到pENTER载体片段；将THBS4目的片段和pENTER载体片段使用T4连接酶进行连接，得到连接产物；将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并扩大培养，提取质粒即得。可用于THBS4蛋白表达，从而得到纯化的THBS4蛋白，有助于后续MG这类慢性肌肉疾病致病机制的研究的开展并且具有作为疾病生物标志物的潜在功能，为后续辅助患者的精准诊疗提供指导。