本发明公开了一种毕赤酵母表达制备重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链的方法。本发明提供了一种编码重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，由此核苷酸序列SEQ ID NO.1所编码的重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。根据本发明所获得的重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链包含成熟的人Ⅱ型胶原α1链的全长氨基酸序列，可有效的支撑Ⅱ型胶原蛋白生物学功能的实现，具有良好的生物学活性，且氨基端、羧基端含有不同的亲和纯化标签，可有效的纯化获取全长单链蛋白，也有利于胶原蛋白的鉴定；同时本发明根据毕赤酵母表达特点，对编码重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链的基因序列进行系统性的计算优化，使其更适于在毕赤酵母中表达。