本发明公开了一种发酵核黄素的发酵培养基及其使用方法，涉及微生物技术领域。所述发酵培养基包括基础培养基和流加培养基，其中所述基础培养基的成分和含量为：葡萄糖10‑20g/L、糖蜜30‑60g/L、油酸钠15‑25mL/L、酵母粉5‑8g/L、磷酸二氢钾1.5‑2g/L、七水合硫酸镁0.1‑0.3g/L、葡萄糖酸锌0.3‑0.5g/L、吐温10‑15mL/L、红霉素5‑15mg/L、氯霉素5‑15mg/L，所述流加培养基的成分和含量为：肌醇5‑10g/L、硫酸铵5‑8g/L、葡萄糖30‑50g/L、复合因子500‑900mg/L。本发明解决了现有技术中依赖经验甚于理论，使得核黄素发酵单位偏低的技术问题。