本发明公开了一种桔梗汤提取物及其制备方法和应用，属于中药化学领域，该制备方法，包括：将桔梗与甘草混合后粉碎、浸泡，得到混合药物；将混合药物的水溶液加热回流，过滤，收集滤液；利用非极性大孔吸附树脂对滤液进行吸附后，洗脱剂洗脱，得到洗脱液；将乙腈与水作为流动相，在液相色谱中对浓缩后的洗脱液进行梯度洗脱分离，收集30％‑33％乙腈水溶液，浓缩、冷冻干燥，得到桔梗汤提取物。桔梗汤提取物包括甘草查尔酮B、甘草皂苷G2与乌拉尔甘草A；该桔梗汤提取物具有抑制金黄色葡萄球菌活性的作用。本发明采用水提、非极性大孔树脂纯化、不同醇浓度分级洗脱等操作，操作方法简单，实现性强，得到的桔梗汤提取物可应用于抗金黄色葡萄球菌药物中。