本发明公开了一种改造脯氨酸4‑羟化酶的方法，该方法通过在待改造脯氨酸4‑羟化酶的特定位点之间的区段进行整体替换，和/或在特定位点进行氨基酸突变能显著提高所得脯氨酸4‑羟化酶的活性和热稳定性，从而得到稳定性和活性优异的脯氨酸4‑羟化酶。本发明的脯氨酸4‑羟化酶可以应用于生产反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸或以反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸为前体的下游产物。