本发明公开了一种三顺反子表达载体、制备方法及应用，属于基因工程技术领域。三顺反子表达载体包括核基质结合区序列以及由两个内核糖体进入位点序列连接而成的三顺反子序列，三顺反子序列的结构为：启动子‑轻链信号肽SPL‑IRESwt‑重链信号肽SPH‑IRESatt‑筛选标记‑Poly A。该载体能同时表达抗体的轻链、重链以及筛选标记基因，克服传统载体重链、轻链及筛选标记基因表达不均衡的问题，提高抗体质量及阳性细胞克隆筛选率，同时载体上含有的核基质结合区序列还能克服转基因沉默，实现转基因在宿主细胞中的高效、长期表达，一方面提高抗体蛋白表达水平，另一方面提高后续单克隆抗体细胞株筛选的有效性。