本发明提供了一种欧乌碱和12‑表‑欧乌碱的分离方法，属于医药领域。其包括：将含有欧乌碱和12‑表‑欧乌碱的混合物C上样至氨基色谱柱，以正己烷－二氯甲烷－甲醇三元混合溶剂为洗脱剂，氨基色谱填料与混合物C的质量比为16‑24：1，分离得到欧乌碱和12‑表‑欧乌碱。该方法无需使用高精度的分离设备(例如HPLC)，仅通过柱分离就能够实现欧乌碱与12‑表‑欧乌碱这两个性质极为相似的同分异构体的有效分离，方法简单有效，可重现性强。