本发明涉及一种基于响应面优化牛骨髓多肽的超滤膜分离及肽序列鉴定方法，该方法首先对蛋白提取工艺参数进行合理的筛选和确定，其次通过响应面优化法对蛋白提取液进行超滤膜分离，该方法得到的蛋白含量高达76.9 mg/mL，分离所得部位进一步用离子交换树脂纯化，并用红外光谱、扫描电子显微镜、二维电泳技术及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱等对多肽进行结构表征和肽序列的鉴定，共鉴定出20种活性肽段序列，其中抗氧化肽10种、抗菌肽7种、降压肽3种。本发明所述的方法具有提取时间短、操作简单、鉴定技术可靠、效率高等优势，易于工业化生产，且为来源于动物骨髓的抗菌、抗氧化、降压等活性多肽的开发及综合利用提供基础参考。